如前文《實（shí）驗動物的常規眼科檢查》一文中所寫，眼（yǎn）科檢查的操作（zuò）流程可因動物（wù）種屬和特點（diǎn）的研究目的而異。如果目的是篩查藥物等（děng）物質對（duì）眼部組織的不良影響（xiǎng），則應至少進行間接檢眼（yǎn）鏡和（hé）裂（liè）隙燈顯微鏡的檢查。根據檢查目的，也可執行其（qí）它程序，比如角膜染（rǎn）色（sè）、角膜（mó）知（zhī）覺檢（jiǎn）查（chá）、角膜厚度測量、眼（yǎn）壓計、眼底照相、熒光血管造影、光學相幹斷層掃（sǎo）描 (OCT, Optical Coherence Tomography) 和視覺係統（tǒng）的電生理評估（例如視網膜電圖、多焦視網膜電圖、視覺誘發電位）。

許多無創性眼（yǎn）科診斷技術，可同時提供眼前節與眼（yǎn）後節的結（jié）構和功能信息。下（xià）麵討論了其中一些技術，對這些（xiē）技術適用於毒理學、眼科研究（jiū）和臨床應用的場景進行了初步討論（lùn）。

01、眼壓測量

眼壓計用於獲得眼內壓 (IOP, Intraocular Pressure) 的間接測（cè）量值。市（shì）麵（miàn）上有幾（jǐ）種（zhǒng）不同的（de）商品化的手持式設備，其便攜性足以（yǐ）供眼科檢查（chá）人員使用，如壓陷、壓平或回彈式眼壓計。對於合同研發組織（CROs, Contract research organizations）使用的多種動物（wù）種屬，通常認為Schiotz壓（yā）陷式眼壓計的結果（guǒ）不準確、不可靠，因此不應用於眼部毒理學研究。由於許多眼壓計最初（chū）設計用（yòng）於人的（de）角膜（mó），用於動物的讀數可（kě）能略不準確，但如果在整個研究期間由同（tóng）一（yī）名檢查者（zhě）使用相同（tóng）的眼壓計，則研究中（zhōng）發生的眼壓變化將是有效的。

大多數實驗動物的 IOP 範圍（wéi）為 12-25 mmHg，雙眼之間的差異應≤5 mmHg。IOP 可受到多（duō）個變量的影響，如：保定技術、動物應激、晝夜節（jiē）律眼位、鎮靜或麻醉、角膜厚度等。如果可能，在進行眼壓測量時，應在整個研究（jiū）期間保（bǎo）持如下細節的統一：每天相同的測量時間、相同的（de）眼壓計和操作技術、同一組檢查人員和保定人員，來測量試驗內所有動物的 IOP。應在散瞳之前（qián）測定眼壓。當眼壓測量（liàng）是（shì）研究的關鍵點時，建議研究開始前先對動物進（jìn）行保定適應和操作適應（yīng）。

最常使用的是壓平式（shì）眼壓計，如Tono-Pen XL®、Tono-Pen Vet®、Tono-Pen AVIA® ，或非接觸式眼壓計。眼壓測量需表麵麻醉時，0.5% 丙美卡因是最常見的選擇。該技術測量壓平角（jiǎo）膜給定區域所（suǒ）需的（de）力，然後（hòu）將該施加力轉換（huàn）為眼壓值（單位（wèi）：mmHg）。一（yī）些壓平式眼壓計具有（yǒu）自我校準的優勢（圖（tú）1），而非接觸式眼壓計可提供紙（zhǐ）質副本用於記（jì）錄保存，兩者都是藥物非臨床研究質量管理規範（fàn）（GLP，Good Laboratory Practice）類研究的理想技術。Tono-Pen XL 和 Tono-Pen Vet® 產生4個（gè）獨立讀數，可對讀（dú）數取（qǔ）平均值，並顯示（shì）IOP和誤差百分比，即單個讀（dú）數之間變異性。Tono-Pen AVIA® 產生10 個獨立讀數，並以置信度百分比報告 IOP 和變異性。對於（yú） Tono-Pen XL®，誤差百分比應 <5%，而對於 Tono-Pen AVIA®，置信度百分比應 >95%。

圖1  Tono-Pen AVIA Vet® 用於測量Dutch Belted Rabbit的眼壓

回彈式眼壓計通過向角膜發射一個小的塑料探（tàn）針頭來確定眼壓，然後探頭反彈回設備中，產生感應電流（liú），由此計算眼壓值。為了準（zhǔn）確測量，探針必須（xū）以水平位置在角膜上擊發，即探針與地（dì）板平行。實驗動物最（zuì）常用的回彈眼壓計是（shì） Tonovet®（圖2a）。Tonovet® 專門針對犬、貓和馬進行（háng）了校準，但也已在其它種屬中可靠地使用。TonoLab 眼壓計是專門為小鼠和大鼠設（shè）計和校準的（圖2b）。在許多實驗動物中，包括犬、兔和大鼠，Tonovet 和 TonoLab 眼壓計具有不需要局部麻醉的優點，並且比 Tono-Pen® 更容易獲得 IOP，其缺（quē）點是在使用前不能自行（háng）校準（zhǔn）。與 Tono-Pen® 和 Tonovet® 一樣，它也取6 個讀數的平均值，並使用眼壓值的左側欄指示誤差百分比。測量時，應沒有錯誤（wù）欄，或者（zhě）欄應該位於屏幕的左下角，以使讀數可以接受。

無論使用何種眼壓計（jì），通常每隻眼應獲得並記錄至少 2-3 個最終平均讀（dú）數。由於除非接觸式外（wài）的所有眼壓計僅給出數字讀數，設備不會創建永久性記錄，因此必須手動記錄 IOP 或將其輸入計算機數（shù）據庫中（zhōng）。

圖2  (a) The Tonovet® 回（huí）彈式眼壓計測量New Zealand white rabbit眼壓  (b) TonoLab 眼壓計小小（xiǎo）的尖端可用於齧齒類（lèi）的（de）眼壓測定（dìng）

02、角膜厚度測量法

角膜厚度測量法是一種無創（chuàng）性（xìng）評價角膜厚度（dù）的方法。 最常使用專門為此目的設（shè）計的接（jiē）觸式超聲設備（例如 PachPen®）進行（圖3），但也可以通過高分（fèn）辨率超聲檢查或（huò）光學（xué）相幹斷層（céng）掃描（OCT, Optical Coherence Tomography）獲（huò）得角膜厚度的測（cè）量結果。在角膜水（shuǐ）腫可被生物顯（xiǎn）微鏡（jìng）檢測出之前，角膜厚度測量法可對角膜厚（hòu）度的細微變化進行評價。角膜厚度可因種（zhǒng）屬的不同，以及角膜區域不（bú）同（tóng）（軸向或周邊）而變化。由於區（qū）域差異（yì），必須（xū）在每個時間（jiān）點從角膜的（de）相同（tóng）區域進行測量，通常選用軸向。

圖3  PachPen 測量New Zealand white rabbit角膜厚度

03、熒光素染色法

在涉及眼局（jú）部給藥、角膜接觸鏡評價的研究，和（hé）使用改良 Hackett-McDonald 評分係統（tǒng）的（de）其（qí）他研究（jiū）中，通常使用熒光素鈉溶液評（píng）價角膜上（shàng）皮的完整性。熒光素（sù）是一種水溶性熒光染料，可被親水性角膜基質保留，但不被角膜上皮保留。它可（kě）用於輔助識別角膜（mó）上皮（pí）缺損，也可用於評價（jià）角膜前的淚膜滯留。熒光素以單個浸漬（zì）條帶（dài）的形式提供，使用時使用無（wú）菌生理鹽水潤濕（shī）。將濕潤的條帶（dài）輕輕塗抹在背（bèi）側球結膜上，注意不要接觸角膜。然後使用鹽水輕輕衝洗多餘的熒光（guāng）素（sù）。或者，可（kě）將熒光素條置於塑（sù）料注射器中，並加入預定體積的無菌生理鹽水，以產生已知熒光素濃度的溶液，然後滴在角膜上。由眼科檢查人員使用帶有鈷藍濾光片的生物顯微（wēi）鏡（jìng）對角膜進行檢查，觀察是否有殘留的熒光。

04、眼部（bù）照相

眼部照（zhào）相可用來（lái）證明眼底等區域無變化，或記錄異常以（yǐ）及監測病變的進展。可在研究期間的不同時間點拍攝照片來進（jìn）行比（bǐ）較，以準確地確定異（yì）常是靜態的還是進行（háng）性的。由於照相增加了（le）額外（wài）的時間、成本和（hé）動物應激（jī），因此（cǐ）並非（fēi）所有研究均需進行。在觀察到病變時，或（huò）很可（kě）能引起眼部異常的研究中（例如眼內植入物，玻璃體內或視網（wǎng）膜下注射研究），可在研究方（fāng）案中將其作為一種記錄（lù）病變的選擇。

眼部（bù）照相可分（fèn）為眼外部（bù）和眼內部。眼外部的（de）拍攝可使用帶有（yǒu）微距（jù）透鏡的標準單鏡頭反光（SLR, Single Lens Reflex）數碼相（xiàng）機，或帶屈光（guāng）度設置調節以允許眼外部和眼前節成像的數字 Kowa Genesis-D 眼底照相機。眼後節的拍攝需要特（tè）定類型的眼底照相機（jī），數字（zì）化Kowa Genesis-D 照相機、RetCam、Phoenix Micron IV 和 Micron X 適用於大多數實驗動物的拍攝（圖4）。這些照相（xiàng）機可適用於間（jiān）接眼部照相、齧齒類動物眼底照相和熒光血管造影。眼底照相的優點是能夠永久保存記（jì）錄，以比較潛（qián）在的研究相關結果，如果有發現，則可（kě）由另一名眼（yǎn）科檢查再次進行獨立審閱（yuè）。

在拍攝照片時，所有照片都（dōu）應使用相同的放大倍率和（hé）照明設置。此外，所有動物均應按相（xiàng）同眼（yǎn）別（bié）順（shùn）序（左和右）進行拍攝，同時應保存動物標識和設備日誌等拍（pāi）攝記錄。上述（shù）標準也可作為標準（zhǔn）操作規程 (SOP, Standard Operating Procedures) 的一部分。

圖4  可用（yòng）於實驗動（dòng）物的眼（yǎn）底相機

05、熒光血管造影

熒光血管造影（yǐng）可用於評價眼內動脈和靜脈的血管完整性。雖然其最常用於檢查視網膜和脈絡膜的血管，但也可用於檢查虹膜血管。在（zài）毒理學研究中最常用於評價供（gòng）試品對於新生血管形成的影響。目前，它（tā）已被應（yīng）用於多種實驗動物（wù），最（zuì）常（cháng）選用的是10%熒（yíng）光素鈉，也有部分研究選擇吲哚菁綠。

熒光血管造影技術（shù）需要散瞳，並（bìng）進行鎮靜或麻醉。將光可激發（fā）的化合物熒光素靜脈注射，可獲得目標組織（脈絡膜視網膜和虹膜）的一係列定時圖像。與熒光素注射相關的並發症可能包（bāo）括滲漏後組織刺激、嘔吐和過敏反應（yīng）。必須在能夠拍攝多（duō）幅、快速排序圖像的眼底照相機上使用激發濾光片 (490 nm) 和（hé）屏障濾光片 (520-520 nm)。Kowa Genesis-Df、RetCam Shuttle、Phoenix Micron X 和 Heidelberg Spectralis cSLO 可用於熒（yíng）光血管造影，且是便攜式的（圖4）。在注射熒光素前，先拍攝對照的彩色圖像（xiàng），然（rán）後每 20s 拍攝一組，獲得連續圖像。由於熒光素填充脈絡膜視（shì）網膜（mó）血管，因此（cǐ）描述了血管流動的各個階段。它（tā）們包括動脈前期、動脈期、動靜脈期、靜脈期及後期。熒光血管造影觀察（chá）到的異常（cháng）可能（néng）包括血管異常（動脈（mò）瘤、新生血管形成）、熒光（guāng）受阻、熒光素滲漏（lòu）、低熒光和高熒光（guāng）。

06、視網膜電圖（tú）/視覺誘發電位

根據毒理學研究目（mù）的，以及可（kě）能受影響的視覺係統的特定方麵，有多種（zhǒng）電生（shēng）理學試驗可用於（yú）評價視網膜和（hé）視覺通路。視（shì）網膜電圖 (ERG, Electroretinography) 是測量（liàng）視（shì）網膜（mó）在受到光刺激時產生的電勢（shì）。標準 ERG 是一種（zhǒng）全視（shì）野刺激，可提（tí）供關於整個視網膜的信息，是視網膜色（sè）素上皮、光感受器和內層視（shì）網（wǎng）膜的群（qún）體反應。對於局（jú）部（bù）視網膜評價可選（xuǎn）用多焦視網（wǎng）膜電圖 (mfERG, multifocal electroretinogram)。對於黃斑區神經節（jiē）細胞的（de）評價可（kě）選用圖形倒（dǎo）轉視網膜電圖 (PERG, pattern reversal electroretinogram)。而為了評價從（cóng）視網膜到視覺皮層的整個視覺（jiào）通路，視（shì）覺誘發電（diàn）位 (VEP, visual evoked potential) 則是首選技術。在這些（xiē）試驗中，全視野 ERG最常用於臨床前毒（dú）理學試驗。ERG 提供了一種非侵入性的可重複評估視網膜功能的方法，它可結合間接檢眼鏡和組織病理學來對視網膜結構和功（gōng）能進行綜合評估。

ERG應（yīng）在散瞳後按標準流程進行，目前（qián）人和犬的ERG有許多可參考的國際指南，可作為試驗（yàn）設計的參考。在獲得全視野ERG過程中，如（rú）下條件建議保持一致：房間照明情況（kuàng）、暗適應、閃光強度、頻率以及使用的鎮靜或麻醉劑劑量。

07、光學相幹斷層掃描

光學相幹斷層掃描是一種高分辨率的無（wú）創成像技術，可提供眼部結構的實時橫（héng）斷麵圖像，最常用於視網膜和（hé）視神經，其軸向分辨率為 2-10 μm，也可用於眼前節的成像。與許多先進的成像技（jì）術（shù）一樣，它需要鎮靜或麻（má）醉、散瞳和專門的設備。當進（jìn）行（háng） OCT 成像時，可（kě）看到所有的（de）單個視網膜層，並測量其厚度，以便隨時間進行定（dìng）量和多次重複（fù）評價。其可測量視盤的杯麵積、盤麵積、杯直徑、盤直徑以及邊（biān）緣麵積。通過 OCT 對前節進行檢查則可了解角膜、前房、虹膜和虹（hóng）膜角膜角的結構信息，且其無需像超聲（shēng）生物顯微（wēi）鏡 (UBM, ultrasound biomicroscopy) 所需的那（nà）樣接觸角膜。它還提供了比 UBM更高的軸向分辨率。OCT 在實驗動物中已（yǐ）應用於（yú）多個種（zhǒng）屬，其在人類疾病動物模型和臨床前試驗中的應用也將越來越多。

隨著技術的進步，頻域 OCT (SD-OCT, spectral-domain OCT) 使用非機械技術，比傳統 OCT 或時（shí）域 OCT (TD-OCT, time-domain OCT) 明顯更快。SD-OCT 同時測量一個光譜中多個波（bō）長的（de）反射光，因此被稱為光譜域。SD-OCT 比 TD-OCT 快 100 倍，每秒可采集 70,000 + 次 A-scan，其掃描速度和次數的增（zēng）加可轉化為更高分辨率。

08、角膜內皮顯微鏡檢查

角膜（mó）內皮（pí）顯微（wēi）鏡可對角膜內皮細胞進行活體非侵入（rù）性的成像觀察，可采用（yòng）接觸或非（fēi）接觸方法進行。一旦可視化，可評價角膜內皮細胞的細（xì）胞形態，並可定量為每 mm 的細胞數量 。正常角膜內皮細胞排列規（guī）則，呈六角形。內皮顯微鏡可評價細胞的密度、多形性和變異情況。由（yóu）於細胞數量可因動物年齡和角膜區域的不同而變化（huà），因此須使用相同年齡的動物對這些變量進行標準化，並檢查軸向角膜。須對動物進行鎮靜或麻醉，以獲得準確（què）的圖（tú）像（xiàng），並可適用於簡化技術的自動化係統。FDA 已經設立（lì）了關於臨床試（shì）驗中角（jiǎo）膜內皮顯微鏡檢查的指南，這些指南可以作為臨床前研究設計的起（qǐ）點。除角膜內皮顯微鏡外，還可選用體（tǐ）內高分辨率共聚焦顯微鏡 (Heidelberg Retina Tomograph with Rostock Corneal Module) 進行角膜內（nèi）皮成像和分（fèn）析（圖5）。

圖5  Heidelberg Retina Tomograph (with Rostock Corneal Module)用於角膜內皮的成像和分析

小結

在本篇文章中，我（wǒ）們總結了在（zài）醫藥行業等（děng）研究場景中（zhōng）的非常規眼科檢查（chá）的適當方法和技術。這些技術將在眼部毒理（lǐ）學領域中越來越普遍，技術人員可在（zài）研究過程中根據試（shì）驗的設計和已發現的（de）眼科學變化等（děng）關鍵因素，來選用進一步的檢查辦法。

參考文獻

[1] Gilger B C, Cook C S, Brown M H. Standards for Ocular Toxicology and Inflammation [M].  2018.